كيف يعمل تفاعل البوليميريز المتسلسل (PCR)

ما هو PCR الذي يجب القيام به مع تسلسل الحمض النووي وتضخيم الجينات

تفاعل البلمرة المتسلسل ( PCR ) هو تقنية وراثية جزيئية لعمل نسخ متعددة من الجين وهو أيضا جزء من عملية تسلسل الجينات.

كيف يعمل تفاعل البلمرة المتسلسل؟

تصنع النسخ الجينية باستخدام عينة من الدنا ، والتكنولوجيا جيدة بما يكفي لعمل نسخ متعددة من نسخة واحدة من الجين الموجود في العينة. تضخيم PCR لجين لجعل الملايين من النسخ ، يسمح للكشف وتحديد تسلسل الجينات باستخدام التقنيات المرئية على أساس حجم وشحن (+ أو -) من قطعة من الحمض النووي.

تحت ظروف خاضعة للرقابة ، يتم إنشاء شرائح صغيرة من الحمض النووي بواسطة الانزيمات المعروفة باسم polymerases الحمض النووي ، التي تضيف ديوكسينوكليوتيدات مجانية (dNTPs) إلى قطعة من الحمض النووي المعروف باسم "قالب". وتستخدم حتى قطع أصغر من الحمض النووي ، تسمى "الاشعال" كنقطة انطلاق للبوليميريز. المواد الأولية هي عبارة عن قطع صغيرة من الحمض النووي من صنع الإنسان (oligomers) ، وعادة ما تكون بين 15 و 30 نوكليوتيدات طويلة. وهي مصنوعة من خلال معرفة أو تخمين تسلسلات الحمض النووي القصيرة في نهايات الجين الذي يتم تضخيمه. أثناء PCR ، يتم تسخين DNA المتسلسل ويتم فصل السلاسل المزدوجة. عند التبريد ، ترتبط البادئات بالقالب (تسمى التلدين) وتفتح مكانًا لبدء البلمرة.

تقنية PCR

إن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أصبح ممكنا من خلال اكتشاف الثرموفايلات و أنزيمات polymerase المحبة للحرارة (الإنزيمات التي تحافظ على السلامة الهيكلية والوظائف بعد التسخين في درجات الحرارة المرتفعة).

الخطوات الواردة في تقنية PCR هي كما يلي:

• يتم إنشاء خليط ، مع تركيزات محسنة من قالب الحمض النووي ، انزيم بوليميريز ، الاشعال ، و dNTPs. القدرة على تسخين الخليط دون تغيير طبيعة الإنزيم يسمح بتغيير طبيعة اللولب المزدوج لعينة DNA في درجات حرارة في حدود 94 درجة مئوية.

• بعد تمسخ ، يتم تبريد العينة إلى نطاق أكثر اعتدالا ، حوالي 54 درجة ، مما يسهل التلدين (ملزمة) من الاشعال إلى قوالب الحمض النووي وحيد تقطعت بهم السبل.
• في الخطوة الثالثة من الدورة ، يعاد تسخين العينة إلى 72 درجة ، وهي درجة الحرارة المثالية لحمض الدناز الطق ، من أجل الاستطالة. أثناء الاستطالة ، يستخدم بوليميراز الدنا السلالة الأحادية الأصلية من الحمض النووي كنموذج لإضافة dNTPs تكميلية إلى 3 'نهايات كل برايمر وتوليد قسم من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في منطقة الجين من الفائدة.
• لا تبقى المواد الأولية التي تم تعشيقها على تسلسلات الدنا التي ليست متطابقة تمامًا ثابتة عند 72 درجة ، مما يحد من الاستطالة للجين موضع الاهتمام.

تتكرر هذه العملية من تغيير طبيعة ، التلدين والاستطالة متعددة (30-40) مرات ، وبالتالي زيادة عدد نسخ الجين المطلوب في الخليط. على الرغم من أن هذه العملية ستكون مملة تمامًا إذا تم إجراؤها يدويًا ، يمكن تحضير العينات واحتضانها في Thermocycler قابل للبرمجة ، وهو أمر شائع الآن في معظم المختبرات الجزيئية ، ويمكن إجراء تفاعل PCR الكامل خلال 3-4 ساعات.

كل خطوة تغيير طبيعة توقف عملية الاستطالة من الدورة السابقة ، وبالتالي اقتطاع خيط جديد من الحمض النووي والاحتفاظ بها إلى ما يقرب من حجم الجين المطلوب.

يمكن أن تكون مدة دورة الإطالة أطول أو أقصر اعتمادًا على حجم الجين موضع الاهتمام ، ولكن في النهاية ، من خلال دورات متكررة من تفاعل البلمرة المتسلسل ، ستقتصر غالبية النماذج على حجم الجين المعني فقط ، سوف يتم إنشاؤها من منتجات كل من الاشعال.

ھﻧﺎك ﻋواﻣل ﻣﺧﺗﻟﻔﺔ ﻣﺗﻌددة ﻟﻧﺟﺎح PCR ﯾﻣﮐن اﻟﺗﻌﺎﻣل ﻣﻌﮭﺎ ﻟﺗﺣﺳﯾن اﻟﻧﺗﺎﺋﺞ. الطريقة الأكثر استخداما لاختبار وجود منتج PCR هو الكهربائي هلام هلام الاغاروز . والذي يستخدم لفصل شظايا الحمض النووي على أساس الحجم والمسؤول. ثم يتم تصوير الأجزاء باستخدام الأصباغ أو النظائر المشعة.

التطور

منذ اكتشاف PCR ، تم اكتشاف polymerases الحمض النووي بخلاف Taq الأصلي. بعض هذه لديها قدرة أفضل على "التدقيق" أو تكون أكثر استقرارًا عند درجات الحرارة الأعلى ، وبالتالي تحسين خصوصية تفاعل البوليميراز التسلسلي والحد من الأخطاء من إدخال dNTP غير صحيح.

وقد تم تصميم بعض الاختلافات في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتطبيقات محددة ، وهي تستخدم الآن بشكل منتظم في المختبرات الجينية الجزيئية. بعض هذه هي PCR في الوقت الحقيقي و PCR عكس النسخ. كما أدى اكتشاف PCR إلى تطوير تسلسل الحمض النووي ، وبصمات الحمض النووي DNA وغيرها من التقنيات الجزيئية.