أدوات هندسة البروتين

01 تفاعل بوليميريز المتسلسل

02 إنزيمات تقييد

كان اكتشاف الإنزيمات المعروفة باسم endonucleases تقييد ضرورية لبروتين الهندسة . هذه الانزيمات قطع الحمض النووي في مواقع محددة على أساس تسلسل النوكليوتيدات. وقد تم عزل مئات الإنزيمات المقيدة المختلفة القادرة على قطع الحمض النووي في موقع متميز ، من سلالات مختلفة من البكتيريا. ينتج قطع الدنا مع إنزيم تقييد العديد من الأجزاء الأصغر ، ذات الأحجام المختلفة. يمكن فصل هذه باستخدام الكهرلوجيا جل أو اللوني.

03 رحلان كهربائي

تنقية الحمض النووي من ثقافة الخلية ، أو قطعها باستخدام إنزيمات تقييد لن يكون لها فائدة كبيرة إذا لم نتمكن من تصور الحمض النووي - وهذا هو ، العثور على طريقة لمعرفة ما إذا كان مقتطفك يحتوي على أي شيء ، أو ما هو حجم شظية لك قطعتها. طريقة واحدة للقيام بذلك هي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. وتستخدم جلات لمجموعة متنوعة من الأغراض ، من مشاهدة قطع الحمض النووي للكشف عن إدراج الحمض النووي وضربات القاضية.

04 انضم إلى قطعتين من الحمض النووي

في البحث الوراثي ، من الضروري في كثير من الأحيان ربط اثنين أو أكثر من خيوط الدنا الفردية ، لإنشاء خيط متماثل ، أو إغلاق حبلا دائرية تم قطعها بواسطة إنزيمات تقييد. يمكن أن تنشئ الإنزيمات المسماة Ligases DNA روابط تساهمية بين السلاسل النوكليوتيدية. إن إنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول وكيناز polynucleotide مهمان أيضاً في هذه العملية ، لملء الفراغات أو فسفرة النهايات "5" ، على التوالي.

05 اختيار الحمض النووي صغير ذاتي النسخ

تُعرف القطع الدائرية الصغيرة من الدنا التي ليست جزءًا من جينوم جرثومي ، ولكنها قادرة على التكاثر الذاتي ، باسم البلازميدات. وغالبا ما تستخدم البلازميدات كناقلات لنقل الجينات بين الكائنات الحية الدقيقة. في مجال التكنولوجيا الحيوية ، بمجرد أن يتم تضخيم الجين موضع الاهتمام ويتم قطع كل من الجين والبلازميد عن طريق إنزيمات التقييد ، يتم ربطهما معا مما يولد ما يعرف باسم الحمض النووي المؤتلف. ويمكن أيضا استخدام DNA (bacteriophage) DNA كمتجه ، كما يمكن أن تكون cosmids ، والبلازميدات المؤتلف التي تحتوي على جينات المكورات البكتيرية.

06 طريقة لتحريك متجه إلى خلية مضيف

ويطلق على عملية نقل المادة الوراثية على ناقل ما مثل البلازميد ، إلى خلايا مضيفية جديدة ، التحول. تتطلب هذه التقنية أن تتعرض الخلايا المضيفة لتغير بيئي مما يجعلها "مختصة" أو قابلة للاختراق مؤقتًا للناقل. Electroporation هو واحد من هذه التقنية. كلما كان البلازميد أكبر ، كلما انخفضت كفاءة الخلايا. يتم استنساخ أجزاء أكبر من الحمض النووي بسهولة أكبر باستخدام البكتيريا ، أو الفيروسات القهقرية أو غيرها من النواقل الفيروسية أو الكوسميدات في طريقة تُسمى transduction. غالبًا ما تستخدم النواقل الفاجيّة أو الفيروسية في الطب التجديدي ، ولكنها قد تتسبّب في إدخال الحمض النووي في أجزاء من الكروموسومات التي لا نريدها ، مسببةً مضاعفات وحتى سرطان.

07 طرق لاختيار الكائنات المحورة جينيا

ليست كل الخلايا سوف تأخذ الحمض النووي أثناء التحول. من الضروري أن تكون هناك طريقة للكشف عن تلك التي تفعل. بشكل عام ، تحمل البلازميدات الجينات لمقاومة المضادات الحيوية ويمكن اختيار الخلايا المحورة جينيا بناءً على تعبير تلك الجينات وقدرتها على النمو على الوسائط المحتوية على ذلك المضاد الحيوي. تعتمد طرق الاختيار البديلة على وجود بروتينات مراسلة أخرى مثل نظام x-gal / lacZ ، أو بروتين مضان أخضر ، والذي يسمح بالاختيار على أساس اللون والمضان ، على التوالي.