التعديلات على أي من مكونات تفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) يمكن أن تغير من جودة النتيجة ، إما عن طريق تحسين أو تقليل إنتاجية المنتج وجودة أو من خلال تحسين خصوصية التفاعل والحساسية. يمكن أن تكون المعلمات التي تؤثر على النتيجة النهائية إما فيزيائية (أي ، درجة الحرارة ، أوقات الدورات) أو الكيميائية (أي تركيز القالب ، ونوع الإنزيم المستخدم). فيما يلي عدة عوامل رئيسية تؤثر على نجاح PCR.
01 الشروط المختبرية النظيفة
بما أن PCR قادر على اكتشاف جزيء واحد من الحمض النووي ، فمن المهم الحفاظ على الظروف البكر في المختبر. دائما ارتداء القفازات الطازجة ، واستخدام الأواني الزجاجية العقيمة والأنابيب ونصائح ماصة والحلول العقيمة ، وتنظيف منطقة العمل قبل بدء العمل.
قم دائمًا بتضمين تفاعلات التحكم ، بدون قالب الحمض النووي وبدون إنزيم ، لضمان أن النتائج ناتجة بالفعل عن تضخيم العينة الصحيحة.
يتأكد معظم الأشخاص من امتلاك مجموعة خاصة من الحلول التي لا تتم مشاركتها لتسهيل عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها وغالباً ما يتم تعيين الماصات المحددة جانباً لتفاعل البلمرة المتسلسل فقط. كما أن أنابيب PCR الخالية من ريبونوكلياز والنيكول ، ونصائح ماصة مقاومة للهباء الجوي وتعمل في غطاء الدخان مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي طرق للحد من المشاكل.
02 المكونات الكيميائية
- لديك 18 إلى 24 قواعد
- لا يوجد هيكل ثانوي (أي حلقات دبوس الشعر)
- توزيع متوازن لأزواج G / C و A / T
- ليست مكملة لبعضها البعض عند الأطراف الثلاثة
- يكون درجة حرارة الذوبان (Tm) حوالي 5-10 درجة مئوية تحت درجة حرارة الصلب ، والتي عادة ما تكون بين 55 و 65 درجة Celcius
يجب أن يكون Tm لكلا البادئات متشابهين للحصول على أفضل النتائج.
03 خليط التفاعل: القالب والطبقات الأولية
تركيزات التمهيدي الأمثل تتراوح بين 0.1 و 0.6 ميكرومول / لتر. يختلف مقدار القالب باختلاف نوع الحمض النووي (الإنسان ، البكتيرية ، البلازميد).
مع وجود عدد قليل جدًا من النماذج ، توجد استراتيجيات أخرى لتحسين النتائج ، مثل زيادة أرقام الدورات أو استخدام "البداية السريعة". اختبر دائمًا البادئات الجديدة مع تفاعل تحكم إيجابي ، للتأكد من أنها تعمل في ظل ظروف تجريبية محددة.
04 خليط التفاعل: نشاط الإنزيم
يمكن أن يؤثر تركيز MgCl2 في خليط التفاعل على نتائج PCR ويمكن أن يلعب دورًا مهمًا في تفاعلات أكثر سرعة. يشكل الكاتيون المغنيسيوم معقدات قابلة للذوبان مع dNTPs لإنتاج الركيزة الفعلية التي يتعرف عليها إنزيم polymerase.
كما تساعد كميات متساوية من جميع dNTP الأربعة على تقليل معدل الخطأ في polymerase. بعض الإضافات مثل البيتين ، BSA ، المنظفات ، DMSO ، الجلسرين ، و pyrophosphatase يمكن أن تؤثر أيضا على خصوصية الإنزيم أو كفاءة التفاعل.
05 نوع Thermocycler
عند التسوق لمعدات مختبرية ، ضع في اعتبارك أن بعض أجهزة thermocyclers أقل دقة من غيرها في الحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة ودقيقة.
هذا هو أحد المجالات التي لن تسفر عندها التكلفة الرخيصة على المدى الطويل عندما تواجه رد فعل صعب أو باستخدام البرايمر الذي يتطلب نطاقًا ضيقًا من درجة حرارة التلدين.
أنابيب تفاعل رقيقة الجدران مصممة لتناسب العلامة التجارية الدقيقة للثرموسكسل الذي تستخدمه ، تساعد أيضًا على تحسين درجات حرارة التفاعل.
06 دورة إعدادات
يمكن تحقيق زيادة الإنتاجية من خلال زيادة مدة التمديد لكل 20 دورة ، للتعويض عن إنزيم أقل لتضخيم المزيد من القوالب. عادة ، أقل من 40 دورة كافية لتضخيم أقل من 10 جزيئات قالب إلى تركيز كبير بما فيه الكفاية لعرضه على هلام agarose ethidium الملطخ بالبروميد .