يعتمد تسلسل الحمض النووي أيضًا على قدرتنا على استخدام الرحلان الكهربي للهلام لفصل خيوط الدنا التي تختلف في الحجم بمقدار زوج واحد أساسي.
تسلسل الحمض النووي
في أواخر سبعينيات القرن العشرين ، تم اختراع تقنيتين لتسلسل الحمض النووي لجزيئات الحمض النووي الطويلة. كانت هذه طريقة سانجر (أو الديديوكسي) وطريقة ماكسام جيلبرت (الانقسام الكيميائي). تعتمد طريقة Maxam-Gilbert على الانقسام النوكليوتيدي الخاص بالمواد الكيميائية ، وأفضل استخدام لتسلسل oligonucleotides (بوليمرات قصيرة النوكليوتيدات ، وعادة ما تكون أصغر من 50 زوجا أساسيا في الطول). طريقة سانجر أكثر شيوعًا لأنها أثبتت أنها سهلة التطبيق من الناحية التقنية ، ومع ظهور تفاعل البوليميراز المتسلسل وأتمتة هذه التقنية ، يمكن تطبيقها بسهولة على سلاسل طويلة من الحمض النووي بما في ذلك بعض الجينات الكاملة. وتستند هذه التقنية على إنهاء سلسلة بواسطة dideoxynucleotides خلال ردود فعل استطالة PCR.
طريقة سانجر
في طريقة سانجر ، يتم استخدام حبلا الحمض النووي لتحليلها كقالب ، ويستخدم بوليميريز الحمض النووي ، في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتوليد خيوط مجانية باستخدام الاشعال.
يتم تحضير أربعة مخاليط تفاعلية PCR مختلفة ، تحتوي كل منها على نسبة معينة من نظائر dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) إلى واحدة من النوكليوتيدات الأربعة (ATP ، CTP ، GTP أو TTP). وتستمر عملية توليف الحمض النووي الجديد حتى يتم دمج أحد هذه النظائر ، وفي ذلك الوقت يتم قطع الجديلة قبل الأوان.
سينتهي كل تفاعل من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) احتواء خليط من أطوال مختلفة من خيوط الدنا ، تنتهي جميعها بالنوكليوتيدات التي سميت ديديوكسي المسمى لهذا التفاعل. ثم يتم استخدام الرحل الكهربائي للهلام لفصل خيوط التفاعلات الأربعة ، في أربعة حارات منفصلة ، وتحديد تسلسل القالب الأصلي على أساس ما تنتهي من خيوط مع ما nucleotide.
في رد فعل Sanger الآلي ، يتم استخدام الاشعال التي تحمل علامات بأربعة علامات فلورسنت ملونة مختلفة. يتم تنفيذ تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، بوجود النيوكليوتيدات الديديوكسي المختلفة ، كما هو موصوف أعلاه. ومع ذلك ، يتم بعد ذلك دمج مخاليط التفاعل الأربعة وتطبيقها على حارة واحدة من الهلام. يتم الكشف عن لون كل جزء باستخدام شعاع الليزر ويتم جمع المعلومات عن طريق جهاز كمبيوتر يولد مخططات لونية تظهر قمم لكل لون ، والتي يمكن من خلالها تحديد تسلسل DNA الخاص بالقالب.
عادةً ، تكون طريقة التسلسل التلقائي دقيقة فقط للتسلسلات بحد أقصى من 700-800 قاعدة أزواج طول. ومع ذلك ، من الممكن الحصول على سلاسل كاملة من الجينات الأكبر ، وفي الواقع ، الجينوم بأكمله ، باستخدام طرق تدريجية مثل التمرين الأولي للمشي وتسلسل البندقية.
في Primer Walking ، يتم ترتيب جزء عملي من جين أكبر باستخدام طريقة سانجر. يتم إنشاء بادئات جديدة من جزء موثوق من التسلسل وتستخدم لاستمرار تسلسل جزء من الجين الذي كان خارج نطاق ردود الفعل الأصلية.
يستلزم التسلسل السلبي بشكل عشوائي قطع شريحة الحمض النووي ذات الاهتمام إلى شظايا أكثر ملائمة (قابلة للإدارة) ، وتسلسل كل جزء ، وترتيب القطع على أساس متتابعات متداخلة. لقد أصبح هذا الأسلوب أسهل من خلال تطبيق برامج الكمبيوتر لترتيب القطع المتداخلة.