طرق لتنقية البروتين

جزء مهم من أبحاث التكنولوجيا الحيوية هو استخدام تقنيات هندسة البروتين لتصميم أو تعديل البروتينات ذات الخصائص المثلى لتطبيقات صناعية محددة. للقيام بهذا ، يجب على العلماء أن يكونوا قادرين على عزل وتنقية البروتينات ذات الأهمية بحيث يمكن دراسة تطابقها ، وخصائص الركيزة ، وردود الفعل مع بروابط أخرى ، وأنشطة محددة.

تعتمد درجة نقاء البروتين المطلوبة على الاستخدام النهائي المقصود للبروتين.

بالنسبة لبعض التطبيقات ، يكفي استخراج الخام. ومع ذلك ، لاستخدامات أخرى ، كما هو الحال في الأطعمة والمستحضرات الصيدلانية ، هناك حاجة إلى مستوى عال من النقاء. لتحقيق هذا يتم استخدام العديد من طرق تنقية البروتين عادة ، في سلسلة من خطوات تنقية.

كل خطوة تنقية البروتين عادة ما تؤدي إلى درجة معينة من فقدان المنتج. ولذلك ، فإن استراتيجية تنقية البروتين المثالية هي الاستراتيجية التي يتم فيها الوصول إلى أعلى مستوى من التنقية في أقل عدد من الخطوات. يعتمد اختيار الخطوات التي يجب استخدامها على الحجم ، والشحنة ، والذوبان ، والخصائص الأخرى للبروتين المستهدف. التقنيات التالية هي الأنسب لتنقية بروتين عصاري خلوي واحد. تنقية معقدات بروتين خلوي عصبي أكثر تعقيدا وعادة ما يتطلب تطبيق طرق مختلفة.

الخطوات الأولى لتنقية البروتين

الخطوة الأولى في تنقية البروتينات داخل الخلية هي إعداد مستخلص خام .

سيحتوي المستخلص على خليط معقد من جميع البروتينات من السيتوبلازم الخلوي ، وبعض الجزيئات الضخمة والعوامل المساعدة والعناصر المغذية. يمكن استخدام المستخلص الخام لبعض التطبيقات في التكنولوجيا الحيوية ، ولكن إذا كانت النقاوة مشكلة ، يجب اتباع خطوات تنقية لاحقة.

يتم تحضير مستخلصات البروتين الخام عن طريق إزالة الحطام الخلوي المتولد عن طريق تحلل الخلية ، والذي يتحقق باستخدام المواد الكيميائية والإنزيمات ، صوتنة أو الصحافة الفرنسية. تتم إزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي ، ويتم استرداد طاف. يمكن الحصول على مستحضرات خام من البروتينات خارج الخلية ببساطة عن طريق إزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بالنسبة لبعض تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، هناك طلب على الإنزيمات القابلة للحرارة : الإنزيمات التي يمكنها تحمل درجات حرارة عالية دون تغيير ، مع الحفاظ على نشاط معين عالي. الكائنات الحية التي تنتج منها تسمى أحيانا المتطرفة. من الطرق السهلة لتنقية بروتين مقاوم للحرارة هو إنكار البروتينات الأخرى في الخليط عن طريق التسخين ، ثم تبريد المحلول (مما يسمح للإنزيم القابل للحرارة بالإصلاح أو إعادة العمل ، إذا لزم الأمر. ويمكن بعد ذلك إزالة البروتينات المعطلة عن طريق الطرد المركزي.

خطوات تنقية المتوسطة

في الماضي ، كانت الخطوة الثانية الشائعة لتنقية البروتين من مستخلص خام هو الترسيب في محلول ذي قوة تناضحية عالية (مثل المحاليل الملحية). يمكن إزالة الأحماض النووية في المستخلص الخام عن طريق ترسيب الركام المكون من كبريت الستربتومايسين أو بروتامين سلفات.

عادة ما يتم ترسيب البروتين باستخدام كبريتات الأمونيوم كالملح.

سوف تترسب بروتينات مختلفة بتركيزات مختلفة من كبريتات الأمونيوم . بشكل عام ، تترسب بروتينات ذات وزن جزيئي أعلى في تركيزات أقل من كبريتات الأمونيوم. لا يؤدي ترسب الملح عادة إلى بروتين عالي النقاء ولكن يمكنه المساعدة في القضاء على بعض البروتينات غير المرغوب فيها في خليط وتركيز العينة. ثم يتم إزالة الأملاح في الحل عن طريق غسيل الكلى من خلال أنابيب السليلوز المسامية ، والترشيح ، أو اللوني استبعاد الجل.

غالباً ما تستفيد بروتوكولات التكنولوجيا الحيوية الحديثة من العديد من المجموعات المتوفرة تجارياً التي توفر حلول جاهزة للإجراءات القياسية. غالباً ما يتم إجراء تنقية البروتين باستخدام الفلاتر وأعمدة الترشيح المحضرة للهلام. كل ما عليك القيام به هو اتباع التعليمات وإضافة الحجم الصحيح من الحل الصحيح والانتظار في الوقت المحدد في حين جمع eluant (ما يخرج الطرف الآخر من العمود) في أنبوب اختبار جديد.

• يمكن تطبيق طرق الكروماتوغرافي باستخدام أعمدة سطح المكتب أو معدات HPLC مؤتمتة. يمكن إجراء الفصل بواسطة HPLC عن طريق الطور العكسي أو التبادل الأيوني أو طرق الاستبعاد بالحجم ، والعينات التي تم اكتشافها من خلال مصفوفة الصمام الثنائي أو تقنية الليزر.

  بروتين التصور وتقييم تنقية

  • يفصل اللوني عكس المرحلة (RPC) البروتينات على أساس hydrophobicities النسبي. هذه التقنية انتقائية للغاية ولكنها تتطلب استخدام المذيبات العضوية. يتم التشويه بشكل دائم بعض البروتينات من قبل المذيبات وسوف تفقد وظائف أثناء RPC. لذلك لا يوصى باستخدام هذه الطريقة لجميع التطبيقات ، خاصةً إذا كان من الضروري أن يحتفظ البروتين المستهدف بالنشاط.
  • يشير كروماتوجرافيا التبادل الأيوني إلى فصل البروتينات على أساس الشحنة . يمكن إعداد الأعمدة إما لتبادل الأيونات أو تبادل الكاتيون. تحتوي أعمدة تبادل الأنيون على مرحلة ثابتة ذات شحنة موجبة تجذب بروتينات سالبة الشحنة. أعمدة تبادل الكاتيون هي الخرز العكسي المشحون سالباً والذي يجذب البروتينات المشحونة إيجابياً. يتم إجراء شطف البروتين (البروتينات) المستهدف عن طريق تغيير درجة الحموضة في العمود ، مما يؤدي إلى تغيير أو تحييد المجموعات الوظيفية المشحونة لكل بروتين.
  • يفصل كروماتوغرافيا الاستبعاد ( الجل الترشيح ) بين بروتينات أكبر من الجزيئات الصغيرة حيث تتحرك الجزيئات الأكبر بشكل أسرع من خلال البوليمر المتقاطع في عمود اللوني. لا تتناسب البروتينات الكبيرة مع مسام البوليمر بينما تقوم البروتينات الأصغر ، وتستغرق وقتًا أطول للانتقال عبر عمود الاستشراب ، عبر مسارها الأقل مباشرة. يتم جمع Eluate في سلسلة من الأنابيب التي تفصل البروتينات على أساس وقت الشطف. يعتبر الترشيح الجلدي أداة مفيدة لتركيز عينة البروتين حيث يتم جمع البروتين المستهدف في حجم شطف أصغر مما كان مضافًا في البداية إلى العمود. يمكن استخدام تقنيات فلترة مماثلة خلال إنتاج البروتين على نطاق واسع بسبب فعاليتها من حيث التكلفة.
  • التقارب اللوني هو تقنية مفيدة جدا "لتلميع" أو إكمال عملية تنقية البروتين. ترتبط الخرزات الموجودة في عمود الكروماتوجرافي بروابط ربط تربط بشكل محدد بالبروتين المستهدف. ثم يتم إزالة البروتين من العمود عن طريق الشطف بمحلول يحتوي على بروابط حرة. توفر هذه الطريقة أنقى النتائج وأعلى نشاط محدد مقارنة بالتقنيات الأخرى.
• SDS-PAGE هو عبارة عن رحلان جل بولي أكريلاميد ، يتم إجراؤه في وجود SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم) التي ترتبط بالبروتينات مما يعطيها شحنة سالبة كبيرة صافية. بما أن رسوم جميع البروتينات متساوية إلى حد ما ، فإن هذه الطريقة تفصل بينها تقريبًا اعتمادًا على الحجم. غالبا ما يستخدم SDS-PAGE لاختبار نقاء البروتين بعد كل خطوة في سلسلة. مع إزالة البروتينات غير المرغوب فيها تدريجيا من الخليط ، يتم تقليل عدد النطاقات المتصورة على هلام SDS-PAGE ، حتى يكون هناك شريط واحد فقط يمثل البروتين المرغوب.
• Immunoblotting هي تقنية تصور البروتينات المطبقة بالاشتراك مع اللوني تقارب. وتستخدم الأجسام المضادة لبروتين معين كما بروابط على عمود اللوني تقارب. يتم الاحتفاظ بالبروتين المستهدف في العمود ، ثم يتم إزالته عن طريق شطف العمود بمحلول ملح أو عوامل أخرى. تساعد الأجسام المضادة المرتبطة بالملصقات المشعة أو الصبغة في الكشف عن البروتين المستهدف بمجرد فصلها عن باقي الخليط.

مصادر:

Zubay G. 1988. Biochemistry، 2nd Edition. Macmillan Publishing Co.، New York، NY، USA.

امرشام فارماسيا للتكنولوجيا الحيوية. 1999. دليل تنقية البروتين ، الطبعة AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database٪20items/protein_purification_handbook.pdf.